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棉花遺傳改良團隊創制出非轉基因無棉酚棉花種質資源
發布時間:2020-08-28


8 月 27 日,棉花遺傳改良團隊在植物學領域主流期刊Plant Biotechnology Journal 雜志在線發表了題為 "The application of temperature sensitivity CRISPR/LbCpf1 (LbCas12a) mediated genome editing in allotetraploid cotton (G. hirsutum) and creation of nontransgenic, gossypol‐free cotton" 的研究論文。該論文驗證CRISPR/LbCpf1介導的基因組編輯系統在棉花基因編輯中的“嗜熱性”,進而可以利用棉花對高溫有較好耐受性的特點,創制純合、無棉酚的非轉基因(Transgene free)棉花材料,為棉花分子育種提供了新的種植資源。


棉花是我國重要的經濟作物之一,是天然纖維、植物蛋白的重要來源。目前種植最多的異源四倍體棉花因其龐大而復雜的基因組,大多數基因在At和Dt亞基因組具有多個同源拷貝,給棉花基因組功能研究帶來巨大挑戰。該課題組前期研究表明Cpf1(Cas12a)蛋白在棉花中具有較好的基因編輯能力,這套系統與Cas9 系統相比具有一定優勢:該系統能夠識別富含胸腺嘧啶(T)的PAM 位點,擴大了基因組編輯的靶點范圍;Cpf1剪切DNA后形成黏性末端,讓DNA插入更可控; 傾向于產生大片段缺失、特異性強、編輯效率高的基因,因此可以作為未來棉花基因組編輯的重要工具之一,能夠和傳統的CRISPR/Cas 9系統形成良好的互補。同時有研究表明Cpf1蛋白屬于溫度敏感性蛋白,發現CRISPR/LbCpf1介導的基因組編輯容易受到溫度的影響,并且通過特定的溫度處理能實現更高的編輯效率。

不同溫度處理后LbCpf1-GhCLA和LbCpf1-GhPGF植株受溫度的影響

不同溫度處理后LbCpf1-GhCLA和LbCpf1-GhPGF植株受溫度的影響

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CRISPR/LbCpf1介導的純合、非轉基因和無棉酚的棉花材料的創制

為進一步探究CRISPR/LbCpf1在棉花中的溫度敏感性以及是否特定的溫度處理有助于實現更好的編輯效率,該研究構建了棉花腺體基因GhPGF基因 LbCpf1的編輯載體,并與前期的葉綠素合成相關基因GhCLA的LbCpf1的編輯載體獲得的棉花植株同時驗證Cpf1蛋白的溫度敏感性。研究結果表明: 在棉花中CRISPR / LbCpf1系統的最佳誘導溫度為34℃。在此溫度下,與24℃和29℃相同,所有T0植物的目標位點僅檢測到DNA缺失,但編輯效率明顯高于24℃和29℃;敲除GhPGF靶基因中的兩個crRNA都被突變。然而,在24℃和29℃處理后,只有第一個crRNA發生突變,第二個crRNA幾乎沒有突變。經過34℃處理后,靶標序列的兩個crRNA都有突變。更重要的是,白化和無腺體的表型更為明顯;通過qRT-PCR 檢測棉花中LbCpf1的表達水平,表明在34℃時LbCpf1蛋白的活性最高;脫靶分析表明:LbCpf1系統在34℃下對棉花基因組沒有發現脫靶作用。在此基礎上,通過篩選獲得了不含棉酚非轉基因、無腺體棉花植株,為棉花育種提供了寶貴的種質資源。

總之,研究表明34℃是CRISPR/LbCpf1在棉花中表達活性的最適溫度,因此,在種子萌發或植物組織培養過程中,通過簡單的熱處理就可以提高棉花的編輯效率。同時,純合、非轉基因和無棉酚的棉花材料的創制為分子育種提供了寶貴的新種質。

我校作物遺傳改良國家重點實驗室張獻龍教授、金雙俠教授為該論文的共同通訊作者,博士生李波和已畢業博士梁思佳為共同第一作者。該研究受到國家科技部轉基因專項(2019ZX08010-003和2016ZX08005-001-006)、國家重點研發項目(2016YFD0100203-9)的支持。

該論文是我校棉花遺傳改良團隊在植物基因編輯領域的第8篇論文,為今后棉花功能基因組研究提供了技術支撐。

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